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抗原修复很重要,各种干货快记牢!
爱必信(上海)生物科技有限公司   2020-05-29 17:40

做多了IHC实验的小伙伴,相信对于抗原修复都不陌生,这看似简单的一小步,往往会对IHC实验产生显著影响。爱必信作为您身边的科研百宝箱,秉持着最严谨认真的态度,为您总结了一系列从修复缓冲液、煮沸装置到修复方法,注意事项的小技巧,希望这些小细节能完善您的实验,像爱必信一直坚信的一样,从小处入手,时刻陪伴您的科研生活,助力实验大成功。

 

抗原修复是针对石蜡包埋的切片的必要步骤,大多数甲醛固定的组织在开始染色前都要先修复抗原,这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联屏蔽了抗原位点。常用的两种方法为热修复法(HIER)和酶解法。

 

一、热修复法

1. 热修复缓冲液

适用于HIER的缓冲液有多种,我们推荐两种常用的缓冲液:pH 6.0,10mM柠檬酸盐缓冲液和pH 8.0,0.5mM EDTA缓冲液。具体使用哪种缓冲液可以参考您的抗体说明书,通常来讲,EDTA缓冲液适合多数磷酸化酪氨酸特异性抗体,而柠檬酸盐缓冲液则适用于其他多数抗体。

 

爱必信为您提供高品质的热修复缓冲液:

  货号  品名  规格   abs9132   Citrate Concentrated Solution   250ml   abs9133  EDTA, 0.5 M, pH 8.0   100ml   abs9147  Sodium Citrate, Dihydrate   500g/1kg


2. 热修复方法

(1)、高压蒸汽法

▲ 将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内,然后将锅置于加热板并开至最大功率,此时不要把盖子盖紧。在等待煮沸过程中,进行脱蜡复水。
▲ 煮沸后,将玻片放入高压锅,盖紧盖子,小心烫伤。
▲ 高压锅达到最大压力后,维持3分钟。
▲ 3分钟后,关掉加热板,将高压锅取下放置。
▲ 释放蒸汽,冷水冷却锅身。压力下降后打开锅盖,冷水冷却10分钟。小心烫伤,修复完毕。

 

注意事项:

● 3分钟只是建议时间,并不是所有抗原的最佳修复时间,可以设置对照试验,分别设定1、2、3、4……分钟进行探索,确定最佳修复时间。
● 确保玻片完全冷却再进行下一步实验。

 

(2)、微波法

微波法不要使用家用微波炉,没有高压环境,修复时间长,会使切片解离。请使用科研专用微波炉。

向微波炉专用容器中加入合适的修复缓冲液
▲ 将玻片放入容器,置于微波炉内。将温度设置在98℃维持20分钟以修复抗原
▲ 20分钟后,取出容器放置于水中冷却10分钟,小心烫伤,修复完毕。

 

注意事项:

● 要确保修复缓冲液足以浸没玻片几厘米,防止煮沸过程中变干。
● 20分钟同样也是建议修复时间,可设置对照试验,自行探究最佳修复时间。
● 确保玻片彻底冷却。

 

 

二、酶解修复法

可依据抗体说明书选择需要的酶,如果没有,胰蛋白酶适用于大多数福尔马林/PFA固定后需要修复的抗原。常使用的酶解修复方法有滴管法和浸泡法。

 

爱必信为您提供高品质的蛋白酶:

  货号  品名  规格   abs9145   胃酶Pepsin(1:3000)   50g/100g   abs9118  蛋白酶K   100mg/1g   abs47047375  胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) 不含酚红   100ml


(1)、滴管法

▲ 将胰蛋白酶预热至37℃。小心的将组织切片周围的水吸干,然后吸取酶溶液滴加到切片上(一般50-100ul)。用吸管尖端将酶溶液铺盖住整个切片,注意不要弄坏组织

▲ 将玻片置于加湿器,然后37℃孵育。避免直接将玻片放入恒温箱架子上,否则会因温度不均影响染色质量。▲ 盛放玻片的容器最好先预热再放入恒温箱内。

▲ 10-20分钟后,取出玻片,流水冲洗3分钟。修复完毕。

 

(2)、浸泡法

将水浴温度设置为酶最适宜温度。向盛放玻片架的两个容器中加入超纯水。容器放入水浴加热。
▲ 将玻片放入水浴箱其中一个容器加热
▲ 用水浴箱中另一个容器中的热水制备抗原修复缓冲液,然后将盛有缓冲液的容器放回水浴箱中重新加热。
▲ 将加热过的玻片放入酶溶液中10-20分钟并间歇缓慢震荡。取出玻片在流水下冲洗3分钟,将酶漂洗干净。

 

注意事项:

有些酶需要特殊缓冲溶液和活性辅助因子。
● 水或缓冲液体积要足够没过玻片
● 若将冷玻片直接放入酶溶液中会使溶液温度降低从而酶活性降低,导致抗原位点修复不彻底。
● 尽可能快的准备出抗原修复缓冲液以避免妨碍酶活性的发挥。放入玻片之前使溶液达到需要的温度。
● 10-20分钟只是建议孵育实验。可自行设置对照实验探究最佳孵育时间。

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